本次主要来理解一下什么是链特异性文库，为什么要构建这种文库。

首先要明确几个概念，对理解后面的讲解很有帮助：

我们可以理解为拿到基因组，从左向右读过去，这条链就是正链。

反链就是与正链互补的链，因为DNA是双螺旋结果，有正链，就会有反链。

正义链也叫编码链，正义链的序列与mRNA 的序列一样，即携带蛋白的编码信息的这一条链。

与正义链互补的链就是反义链，也叫模板链，其序列与mRNA 互补。

看最左边的普通RNA建库方式： 1.首先把RNA逆转录成 cDNA, 图中的RT指的是reverse transcript 即反转录酶 2.制备完的文库，是双链cDNA， 在cDNA的两端，会加上两个对称的Y型接头，这种情况下，测得结果，我们无法确定是来自正链还是反链。

中间这幅图多展示的是用dUTP做链特异性文库： 1.使用随机引物合成RNA对应的一条cDNA链 2.接着合成cDNA的第二条链，此时采用 dUTP取代dTTP。 3.之后在两端加上接头。 4.再用USER酶处理，将含有U的cDNA链去除，此时，文库中存在的只有一条反链。 5.剩下反链两端的接头是不一样的。 6.下一步通过PCR 扩增，扩增出来的文库，保持了模板上的两个不对称的接头序列。 7.上机测序。 8.测序的过程中是可以分辨正链和反链的。

在做reads比对的时候，如果是正链reads比对到基因方向，那这个read是正义链reads， 如果是正链reads比对到基因反方向，那这个reads 就是反义链reads。

那这样建库的意义是什么呢，这就和lncRNA 的特点有关了，有关lncRNA可以写很多的笔记，这里着重记录几个作为介绍：

1. 如果不能区分reads来自哪一条链，那么NAT lncRNA 与mRMA就区分不出来了
2. 从思考问题的熊的博客 中，可知道如果把链特异性文库当做普通的文库来计算，对某一个基因来说影响不大，因为反义链的表达水平相对较低，但是如果是普通建库当做链特异性建库处理，结果误差会比较大。所以说，如果在非普通情况下，不用链特异性文库，我们得到的基因表达量是有问题的。
3. 通过这种文库方式，可以挖掘顺式天然反义转录本

还有很多的好处，这里不一一列举