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大熊猫肠道微生物抗生素抗性基因综合分析
imeta主页：http://www.imeta.science
研究论文
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.171
● 2024年2月6日，美国阿肯色大学赵江潮、佛山科学技术学院李英、中国大熊猫保护研究中心王承东等团队在imeta在线发表了题为 “A comprehensive analysis of antibiotic resistance genes in the giant panda gut” 的文章。
● 本研究开发了一个针对大熊猫肠道菌群的宏基因组组装基因组（MAGs）数据库，可以利用宏转录组测序技术来阐明圈养大熊猫中ARGs表达模式，以及调查水平基因转移的潜力，揭示可能对这一濒危物种产生的人为影响。
● 第一作者：邓飞龙、韩燕华、黄宇珊、李德生
● 通讯作者：赵江潮(jzhao77@uark.edu)、李英(yingli@fosu.edu.cn)、王承东(wolongpanda@qq.com)
● 合作作者：柴建民、邓林华、魏明、吴凯、赵华斌、杨冠
● 主要单位：广东省动物分子设计与精准育种重点实验室 、佛山科学技术学院 生命科学与工程学院、 中国大熊猫保护研究中心 、武汉大学生命科学学院、香港城市大学 、阿肯色大学
亮 点
● Pbac是一个相对完整的大熊猫肠道微生物基因组数据库；
● 一种未鉴定的物种（梭状芽胞杆菌属）是野外大熊猫ARGs的主要宿主；
● RPOB2基因在大熊猫肠道中显著高表达；
● 人类肠道微生物对圈养大熊猫肠道ARGs有显著影响。
视频解读
Bilibili：https://www.bilibili.com/video/BV1g4421c7Yb/
Youtube：https://youtu.be/fc0-Db9171s
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请访问期刊官网：http://www.imeta.science/
全文解读
引 言
大熊猫因其重要象征意义且濒临灭绝，而受到国际社会对其保护的关切。尽管政府和科学界的共同努力，使其种群数量的显著增长，但大熊猫群体仍面临危机。大熊猫面临的挑战包括栖息地破碎化，其阻碍大熊猫基因交流。此外，多种原因导致的繁殖率较低，以及对各种病原体疾病的易感性，都对大熊猫的生存构成威胁。
大熊猫肠道内复杂的微生物群落对其健康、消化和免疫功能起着至关重要的作用。由于大熊猫独特的饮食习惯（以竹子为主），肠道菌群在消化纤维和蛋白质利用方面可能起着关键作用。此外，肠道内的致病微生物可能对大熊猫构成威胁。值得注意的是，与其他系统性疾病相比，胃肠道疾病在圈养熊猫中更为普遍，频繁使用抗生素导致抗生素抗性的增加。而人源抗生素抗性基因传播对大熊猫的威胁同样让保护生物学领域感到担忧。抗性基因在大熊猫肠道内聚集可能加剧其的健康风险升高，削弱用于治疗大熊猫治疗效果。
理解大熊猫肠道菌群中ARGs的分布，以及识别ARGs的微生物宿主，对于制定有效的抗生素抗性防治策略至关重要。肠道微生物组中的ARGs受多种因素影响，包括年龄、饮食模式、季节变化、栖息地特征、地理位置和管理实践等。尽管既往研究利用宏基因组测序相关研究对大熊猫ARGs的分布和关键驱动因素进行了调研，但仍有必要对其进行深入探索。鉴于此，本研究旨在：（1）开发一个针对大熊猫肠道菌群的宏基因组组装基因组（MAGs）数据库；（2）利用宏转录组测序技术来阐明圈养大熊猫中ARGs表达模式；以及（3）调查水平基因转移的潜力，特别关注从人类肠道菌群到大熊猫肠道菌群的ARGs转移，揭示可能对这一濒危物种产生的人为影响。
结 果
大熊猫肠道微生物基因组数据库构建
在既往研究中，我们采用混合装策略组装了610个中等以上质量MAGs。本研究，采用独立的组装策略重新对样本进行组装分析，合并既往组装结果，共获得了2684个符合中等质量阈值的MAGs（完整性≥50%，污染＜10%，长度≥500 kb）。其中960个（占35.77%）MAGs超过了高质量标准（完整性≥90%，污染＜5%）。使用99%相似度聚类，得到1193个非冗余的菌株水平MAGs，其中包括354个高质量MAGs。与既往研究相比，本研究包含了更多的非冗余MAGs（1193 vs. 408和820）和高质量MAGs（354 vs. 149和174）。
图1. 大熊猫肠道微生物MAGs的系统发育关系，以及抗生素抗性基因（ARG）概述的比较分析
（A）大熊猫肠道的MAGs的系统发育树。每种背景颜色对应一个不同的细菌门，外圈红色分支表示新物种。（B）圈养与野生大熊猫肠道微生物组中ARG相对丰度的比较。方差分析（ANOVA）用于评估统计显著性。（C）野外和圈养两个熊猫群体肠道微生物组中ARG类别的堆积条形图。"AA"表示aminoglycoside:aminocoumarin。（D）野外和圈养大熊猫肠道ARG相对丰度和ARG表达水平。突出显示的圆形/点表示由特定细菌物种宿主的ARGs。（E）不同宿主物种在野生和圈养大熊猫中平均ARG丰度的比较贡献。（F）在宏基因组（Number of Observed ARGs）和宏转录组（Number of expressive ARGs）数据集中检测到的ARG类型的比较。只有超过计数超过1/1M的ARG用于分析，相同大熊猫个体的样本通过线连接。（G）圈养熊猫样本中不同ARG类别的宏基因组丰度与宏转录组表达水平的可视化。每个圆圈的直径对应其ARG类别的宏基因组丰度。颜色渐变，从蓝色转变为红色，表示每个ARG类别的宏转录组表达相对于宏基因组丰度的对数变换的倍数变化。位于上方的条形图显示了表达的ARGs的总丰度。AA代表aminoglycoside:aminocoumarin。（H）与非解乳糖链球菌相关的ARGs在大熊猫肠道中的平均相对丰度和表达丰度。
1193个非冗余MAGs中包含11个门和71个细菌科。其中，厚壁菌门为优势菌（包括503个MAGs/ 42.16%），其次是变形菌门（包括357个MAGs/29.92%），厚壁菌门A（包括167个MAGs/14.00%），以及拟杆菌门（包括59个MAGs/4.95%）。在属水平上，1193个MAGs对应GTDB中的171个属；此外，11个MAGs未在GTDB中鉴定到参考分类。使用85%的相似度聚类，获得6个属水平的类簇。在物种级别上，672个MAGs被映射到219个已知物种。其余521个MAGs未能在GTDB数据库中注释，以95%的相似度对其聚类，共获得228个物种水平的类簇。
Turicibacter SGBP131包含23个代表性MAGs，在本研究中Turicibacter SGBP131被鉴定为新物种，多次独立地被组装出来，其作为新物种较为可靠。此外，我们还鉴定出了39个新的候选物种，这些物种至少包含3个独立的菌株。其中包括campylobacter SGBP104（25个MAGs），Turicibacter SGBP131（23个MAGs）和clostridia SGBP116（20个MAGs）。结果表明大熊猫肠道微生物组中存在大量以前未被鉴定的新物种。结果为后续分析提供了一个全面的参考。为了便于访问，所有MAGs及相关信息已在我们的在线数据库http://www.pbac.top上提供。
大熊猫肠道微生物ARG和MGE宿主鉴定
从代表性MAGs中鉴定到10,224个ARG，并发现大肠杆菌是主要的宿主，携带65种不同的ARG类型，其次是葡萄牙柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌。此外，大肠杆菌属的两个物种（Escherichia marmotae和Escherichia sp001660175）表现较高的ARGs基因密度，分别为27个和28个ARGs/2000基因。
本研究从233个MAGs鉴定到 713个可移动遗传元件（MGEs）。其中507个MGE被鉴定为"tnpA"。Acinetobacter nosocomialis, Enterococcus B faecium和 JGM124 SGBP173分别携带29个、20个和19个MGEs。我们将距离小于5000bp的ARG和MGE定义为共现事件。共鉴定到26个ARG与MGE共现事件。其中，来自大肠杆菌的MAGs上鉴定到8对MGE和ARG共现事件。3个属于鲍曼不动杆菌属的物种发现了7个共现事件。值得注意的是，4种由tnpA介导的共现事件发生在Limosilactobacillus mucosae和Lactobacillus johnsonii上，而这两种菌是典型的益生菌。
野外与圈养大熊猫抗生素抗性基因比较
对圈养和野生大熊猫之间在抗生素抗性基因（ARGs）的丰度、类型和宿主方面的差异进行分析。圈养大熊猫的ARGs相对丰度高于野生个体（p = 2.10×10-10），这与先前研究的发现相一致。多药耐药是野生和圈养大熊猫中最丰富的ARG类型，其次是β-内酰胺类、肽类和氟喹诺酮类。上述所有ARG类型在圈养大熊猫中都有显著富集（p < 0.01）。
差异分析表明，有444个基因在圈养大熊猫中显著富集，而347个基因在野外大熊猫中更高（图1D）。在圈养大熊猫中，显著富集的ARGs主要与大肠杆菌相关，其次是非解乳糖链球菌。这2种细菌构成了圈养大熊猫肠道总ARG丰度的88.90±12.13%。相反，在野生大熊猫中，clostridium SGBP116（一种新物种）和大肠杆菌作为主要的ARG宿主。本研究中发现clostridium SGBP116对野生大熊猫健康的潜在影响，值得进一步调查和考虑。
圈养大熊猫抗生素抗性基因表达模式
在宏基因组数据中观测到的ARG数量显著高于宏转录组数据中表达的ARG数量（p = 2.98×10-6），表明部分ARGs基因处于沉默状态。丰度最高的ARG类别是多药耐药类，平均相对丰度为3154.11 reads /million。与此同时，多药耐药类也是表达最多的类别，平均表达丰度为2017.05 reads /million。值得注意的是，尽管“β-内酰胺”ARG类的相对丰度较低，平均为770.64 reads /million，但其在表达上排名第二（1419.42 reads /million），表明其表达活性较高。
RPOB2基因（已知对利福平有抗性）表现出异常高的表达活跃性，其表达丰度占总表达ARGs的67.47%。利福平是人类常用的药物，已被证明对大熊猫中的几种细菌物种（包括肺炎克雷伯菌）具有活性。由RPOB2相关抗生素（如利福平）产生的选择压力，特别对圈养大熊猫肠道微生物，值得进一步探究。
人与大熊猫肠道微生物互作的潜在影响
从人类肠道的13,042个微生物基因组中，鉴定出了383,943个抗生素抗性基因（ARGs），聚类分析（99%）共获得6977个基因簇，其中1217个与大熊猫肠道微生物中发现的ARGs具有较高的遗传相似性（>99%）。这些ARGs与72个不同的物种相关。与野生大熊猫相比，圈养大熊猫中与人类同源的ARGs的相对丰度更高（42.37% vs. 22.14%）。表明人肠道微生物和大熊猫肠道微生物之间可能存在的微生物或者基因交换，这可能是由共享环境和密切的互动引起的。未来的研究应致力于分离携带这些ARGs的细菌，并探索人类和大熊猫之间水平基因转移的可能途径。
本研究方法具有一定的局限性，包括算法偏差和数据库完整性。由于缺乏替代方法，目前这些限制暂时无法解决。因此，未来需要开发和采用更高精度的方法来量化抗性基因表达。
方 法
1. MAGs构建
本研究涉及322个来自圈养和野生大熊猫的粪便样本，详细信息见先前的研究论文。另外，还新增了7个野生大熊猫的宏基因组测序样本。原始reads通过Kneaddata pipeline v0.7.2 (https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata) 进行预处理。即可，使用Trimmomatic v0.39修剪原始reads中低质量部分（Phred < 20超过4 bp）并去掉长度小于60 bp的reads。Bowtie2 (version 2.2.5)用于识别大熊猫（GCF_002007445.1）和竹子基因组（GCA_017311315.1 和 GCA_011038535.1）的reads。使用spades (v3.15.5) 软件以“--meta”模式和默认参数对样本进行独立组装，以降低MAGs污染。随后，使用metaBAT2 (version 2.12.1)对长于2000 bp的scaffolds进行分箱。使用dRep软件 (v3.4.3)和参数‘-sa 0.99’去除冗余bins。使用CheckM v1.1.3 (lineage_wf)分析bins（MAGs）的质量，包括完整性和污染情况。最终保留长度>500kb、完整性≥50%、污染<10%的MAGs。MAGs的tRNA和rRNA基因使用Barrnap v0.9 (https://github.com/tseemann/barrnap) 和tRNAscan-SE (v 2.0.9)进行注释。使用GTDB-TK v1.5.0和GTDB数据库（R06-RS202, 2022年3月21日）对MAGs进行分类学注释。无法在GTDB数据库中被归类到已知物种的MAGs被认为是新物种。为了构建所有代表性MAGs的系统发育树，使用PhyloPhlAn (version 3.0.2) 对非冗余MAGs构建了最大似然系统发育树。并使用iTOL（version 6.5.2）进行可视化。
项目开发名为“Pbac”的在线数据库来存储组装的MAGs，提供免费的搜索和下载服务。这个数据库使用Django框架和Python构建，并已部署在阿里云上。数据库提供的额外服务的详细描述见http://www.pbac.top。
2. ARG和MGE识别
代表性MAGs经Prodigal基因预测，并使用DeepARG v2 (LS模型) 进行ARGs鉴定，参数为"--min-prob 0.8 --arg-alignment-identity 50 --arg-alignment-evalue 1e-10 --arg-num-alignments-per-entry 1000"。通过将基因的蛋白质序列与 “MobileGeneticElementDatabase”数据库进行比对鉴定MGEs，使用DIAMOND（version 2.0.12）进行比对，标准为e-value ≤ 10-5, query coverage> 80%和 sequence identity> 80%。使用自定义Python脚本来识别MGEs和ARGs的共现事件。
人类肠道微生物基因组信息从NCBI/Genome数据库检索（ 2023年9月4日）。然后，从其中随机选择并下载微生物基因组。去除基因组长度小于200kb的基因组后，共有13,042个微生物基因组用于下游分析。Prodigal（v2.6.3）用于基因预测， DeepARG v2.0用于（LS模型）ARG识别，参数为“--min-prob 0.8 --arg-alignment-identity 50 --arg-alignment-evalue 1e-10 --arg-num-alignments-per-entry 1000”。利用CD-hit-est软件（version 4.8.1）以99%的相似性将与大熊猫相关的ARGs进行聚类，然后使用CD-hit-est-2d（version 4.8.1）以99%相似性将其映射到与人类相关的ARG序列上，以识别潜在的同源ARG基因。
3. 丰度、表达和差异分析
原始宏转录组数据经过质量控制、宿主污染物过滤和rRNA过滤，使用Salmon软件（v1.6.0）的quant模式计算了宏基因组和宏转录组样本中ARG读取的丰度。为了计算不同样本中ARGs的相对丰度和表达，将ARG基因的丰度标准化为每百万读取的计数。使用DESeq2分析野外和圈养大熊猫群体之间差异ARGs基因，以多重矫正p值（p-adjusted）小于0.05和|FC|大于1的显著性阈值。
讨 论
本研究建立了大熊猫肠道微生物MAGs数据库，涵盖了445个物种中的1,193个非冗余基因组。对MAGs全面分析，获得了ARGs菌株水平的宿主以及表达谱。值得注意的是，大熊猫中发现部分ARGs与人类肠道微生物组中存在的ARGs同源，表明可能存在ARGs在两者之间的转移。研究不仅为大熊猫提供了重要的细菌参考基因组，而且还推进了我们对大熊猫肠道微生物组中ARG动态的理解。
引文格式：
Feilong Deng, Yanhua Han, Yushan Huang, Desheng Li, Jianmin Chai, Linhua Deng, Ming Wei, Kai Wu, HuaBin Zhao, Guan Yang, Jiangchao Zhao, Ying Li, Chengdong Wang. 2024. A comprehensive analysis of antibiotic resistance genes in the giant panda gut. imeta e171. https://doi.org/10.1002/imt2.171
作者简介
邓飞龙（第一作者）
● 博士，佛山科学技术学院硕士生导师。
● 2019年毕业于四川农业大学动物遗传育种与繁殖专业，获得博士学位。2020年起就职于佛山科学技术学院生命科学与工程学院。擅长组学数据的分析与挖掘，目前主要从事动物肠道微生物功能研究，致力于挖掘对动物健康有重要影响的微生物。至今在各类学术期刊发表学术论文30余篇，其中，以第一或者通讯作者在imeta, Microbiome, Gut microbes和Journal of Animal Science and Biotechnology等期刊发表学术论文18篇，申请获批发明专利2项，申请软件著作权登记证书3项，主持省级课题2项，市厅级课题1项。
韩燕华（第一作者）
● 佛山科学技术学院硕士研究生。
● 2023年6月毕业于河南科技大学动物药学专业，获得学士学位。2023年9月就读于佛山科学技术学院生命科学与工程学院攻读硕士学位。主要参与动物肠道微生物功能相关课题研究。
黄宇珊（第一作者）
● 佛山科学技术学院动物科学专业本科在读。
李德生（第一作者）
● 现任中国大熊猫保护研究中心副主任，首席专家，正高级工程师（专业技术二级）。
● 2012 年毕业于四川农业大学，获农学博士学位。先后以主持或主研身份完成多个国家级、省部级和国际合作科技攻关项目，在大熊猫圈养种群管理、野化放归研究和疾病防控等方面成果显著，为完善大熊猫疾病防控关键技术、攻克圈养大熊猫繁育“三大难关”、建立圈养大熊猫野化放归技术体系等做出重要贡献。积极推广“爱心饲养”理念，提升圈养大熊猫饲养管理水平，熊猫中心大熊猫圈养种群数量达到370余只，成为全球规模最大、遗传多样性最好的圈养种群。积极推进“母兽带仔野化培训”研究，先后组织完成了11只大熊猫的野化培训与放归，存活9只。在大熊猫重大疫情中，带领专业技术团队创新性开展工作，及时遏制疫情扩散，全力救治患病个体，把损失降到最低，确保了圈养种群的安全。先后获得了国家科技进步二等奖、中国青年科技奖、梁希林业科技进步一等奖、中国林业青年科技奖、四川省科技进步一等奖以及四川青年科技奖等10余项重要科技成果奖励，入选“百千万人才工程”国家级人选，荣获有突出贡献中青年专家和全国优秀科技工作者称号，当选第十一届全国青联委员。
赵江潮（通讯作者）
● 博士，现任美国阿肯色大学动物科学系教授。
● 在中国农业大学分别获得植物保护学学士（1998）与植物病理学硕士学位（2001），在美国威斯康辛大学麦迪逊分校获得生物信息学硕士学位（2004）、环境微生物学博士学位(2009）。2009-2015年，在密歇根大学医学院从事肺脏微生物组与囊肿性纤维化关系的研究。2015年，就职于阿肯色大学。他目前的研究主要集中于微生物组在人和动物健康和疾病中的作用。他利用多学科交叉手段，如各种组学技术（宏基因组学、环境转录组学、代谢组学）、生物信息学、统计学和大数据分析等，研究胃肠道、呼吸道微生物组与人和动物健康的关系，益生菌和益生元与人和动物健康的关系。以第一作者或通讯作者在PNAS、 Current Biology、 Microbiome以及Gut Microbes等著名期刊发表多篇有影响力的论文。任Microbiome 、Animal Microbiome、 Applied and Environmental Microbiology、 Journal of Clinical Microbiology等杂志编委。主持/核心骨干参与美国农业部、沃尔玛基金会等科研项目20余项，超过560万美元。获得美国专利3项。
李英（通讯作者）
● 现任佛山科学技术学院生命科学与工程学院副院长，研究员。
● 2005年博士毕业于中国科学院昆明动物研究所，获动物学博士学位，2009-2012年在美国密西根大学做博士后研究。担任中国畜牧兽医学会动物微生态分会常务理事。曾获得第十一届“李汝其”动物遗传学奖和第十四届四川省青年科技奖。2006年获得中科院 “西部之光”人才计划资助，2012年入选四川省 “百人计划”青年项目（现四川省“千人计划”）。2013年获得四川省杰出青年基金资助，同年入选第十批四川省学术和技术带头人后备人选。2017年获得四川省有突出贡献的中青年专家称号，2019年获得第三届四川省 “十大科教领军人才〞称号。主要从事肠道菌群与动物健康和环境适应性研究，在Nature Genetics、Current Biology、Microbiome等期刊上发表SCI 论文63篇，被Science等期刊引用800多次，所发表的论文得到国内外同行和媒体的认可和关注。研究工作被美国Science Daily《科学日报》，The Washington Post《华盛顿邮报》以及国内《科学时报》等多家媒体报道。主持多项国家和省部级项目。
王承东（通讯作者）
● 现任中国大熊猫保护研究中心疾病防控研究室副主任，正高级工程师。
● 2015 年博士毕业于四川农业大学，获农学博士学位，2022.04-2023.04 美国普渡大学访问学者，担任中国畜牧兽医学会兽医外科学分会理事。曾获第十二届四川省青年科技奖、2016年联合国教科文组织中华人民共和国人与生物圈国家委员会青年科学奖、2018年国家市场监督管理总局中国标准创新贡献奖，2017年入选国家林业局“百千万人才工程”。主要从事大熊猫等珍稀野生动物繁育和疾病防控研究，主持多项国家和省部级项目。在相关期刊上发表中英文论文180余篇，取得国际国内发明专利授权6项，主导和参与制定行业标准两项。
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期刊简介
“imeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！目前期刊已经被ESCI、Scopus等数据库收录。
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